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    公开号:WO1989012044A1
    申请号:PCT/JP1989/000518
    申请日:1989-05-25
    公开日:1989-12-14
    发明作者:Shigeru Narita；Takayasu Kitagawa
    申请人:Shionogi & Co., Ltd.；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 ベンゾ ト リアゾール誘導体およびそれを含有する発螢光試薬 技 術 分 野
    [0002] 本発明は、 薬物と蛋白の結合力評価、 と りわけ塩基性薬物と α 酸性 糖蛋白（以下、 a i-A Gと言う ）の結合力を評価するのに最適な蛋白結 合測定用試薬に関する。
    [0003] 図面の簡単な説明
    [0004] 図面は化合物 1の濃度と螢光強度の関係を示す図であり、 横軸は化合 物 1 の濃度（ X I 0 _6M )を、 縦軸は螢光強度（％)を示す。
    [0005] 背 景 技 術
    [0006] 薬物と血清タンパクとの結合を定量的に評価することは、 薬物の生体 内挙動を解明する上で重要である。 近年、 塩基性薬物の血中における結 合蛋白と して a Gが重要視され、 種々の薬物との相互作用に閔する 報告が増えつつある。 薬物の蛋白結合力評価法のひとつである螢光ブ π—ブ法は高感度かつ簡便性などの利点を有しているが、 現在知られて いる螢光プローブは a A Gに対する結合力評価に適しているとは言え ない。 例えば、 オーラ ミン 0 ( Auramin 0)やフェンブロクモン（ Phenp rocouraon )が知られ、 a A Gに対する螢光プローブと しての研究報告 がある。 前者は、 杉山等によりバイオケミカル ' ファ一マコ口ジ一第 34 卷 6号第 821二 829頁， 1985年（Y. Sugiyama et al, Biochem. Pharmcol. 34(6), 821-829(1985〉）に報告されているが、 0： A Gとの結合力が弱 く微量の蛋白定量の際、 測定感度が低いという欠点がある。 また、 後者 はオタギリ等によりジャーナル ' ォブ · ファーマシューティ カル ' サイ エ ン ス第 76卷 8号第 646-649頁， 1987年（ M. Otagiri et al, J. of Pharmaceutical Sciences 76( 8 )， 646-649( 1987) )に報告されているが、 測 定波長が短波長側にあり、 蛋白自体の螢光による影響を受け易い等の欠 点力 ある。
    [0007] 尧 明 の 開 示
    [0008] 本発明者等は以上の点に鑑み、 蛋白、 特に α A Gに高い親和性を有 し、 かつ、 長波長側で測定可能な螢光プローブの開発を目指して、 本癸 明を完成した。
    [0009] 本発明が提供する次式：
    [0010]
    [0011] (式中、 R 1は水素、 低級アルキル、 ハロゲン、 シァノ、 または低級ァ ルキルォキシカルボニルを表わし、 R 2および R 3は各々、 水素、 低級ァ ルキル、 C s〜 C ンクロアルキルも し くはァリールを意味するか、 また は一緒になつて C 3〜 C 7アルキレンを表わすか、 あるいは隣接窒素原子 と一緒になってビペラジノ も し くはモルホリ ノを形成する。 ）で示され るベンゾ トリァゾール誘導体またはその塩（以下、 単に本尧明化合物と いう ）は、 単独では水溶液中で殆ど無螢光性であるが、 O -A G等の蛋 白の存在下ではこれと結合して強い螢光を示す。 また、 本発明化合物は 各種の塩基性薬物と蛋白の同一結合サイ トにおいて競合し、 その際、 螢 光強度の変化が観測される。 この螢光強度の変化より、 当該薬物の蛋白 との結合力を評価するものであるが、 公知の螢光プローブ法によって高 精度でかつ簡便に測定可能である。
    [0012] 本発明化合物は先にも述べた様に、 蛋白との結合親和性が非常に高い ので、 血中微量蛋白量、 特に 量の定量も容易に行なう事ができ る。
    [0013] 本発明の提供するべンゾトリアゾール誘導体は有機化学の公知の反応 を用いて容易に製造可能である。 例えば、 以下に示すように、 5 -置換 — メ タ フ エ二 レ ンジァ ミ ン（ a )とバラ フヱ二レ ンジァ ミ ン誘導体（ b )と を公知のジァゾカツプリング反応（第 1工程）、 続いて閉環反応（第 2 工程） に付して本発明化合物を得る事ができる。
    [0014]
    [0015] (式中、 R R 2および R 3は前記と同意義である。 ） 以下に各工程の説明をする。
    [0016] (第 1工程）
    [0017] 本反応は通常、 氷冷下〜 1 5 eCにて水溶液中で行なう。 化合物（ b )を 無機酸に溶解または懸濁し、 亜硝酸ナ トリゥム等の亜硝酸と反応させて 反応性に富んだジァゾ化合物を得る。 過剰の亜硝酸を除去するため、 ス ルフア ミ ン酸ゃ尿素を添加してこれを分解する。
    [0018] 次いで、 化合物（ a〉を添加すれば容易にジァゾ化合物と力ッブリング を起こ して化合物（ c )を与える。 反応は数分〜数時間で完了する。 (第 2工程）
    [0019] 化合物（ c〉のァゾ基は、 隣接するァミンと容易に反応を起こして閉環 し、 本発明化合物（ I )を与える。 反応は銅 · アンモニア錯体の存在下、 含水有機溶媒中で行なえば、 室温〜加熱下、 数分〜数十時間で完了す る。
    [0020] 本発明において、 ハロゲンとはフルォロ、 クロ口またはブロモを意味 する。 低級アルキルとは直鎖状または分枝状 C i ~ C 5アルキルを意味 し 、 具体的にはメチル、 ェチル、 II-ブロ ビル、 イ ソプロ ビル、 n-プチ ル、 sec—ブチ■>レ、 tert—ブチル、 n-ペンチル、 ィ'ソペンチル ネオペン チルまたは tert-ベンチル等が例示される。
    [0021] C 3 ~ C 7シクロアルキルとはシク πブロビル、 シクロブチル、 シクロ ペンチル、 シクロへキシル、 シクロへブチルを意味し、 これらは 1〜 2 個のハ πゲン、 低級アルキル、 低級アルキルォキシ等の置換基を有して も良い。
    [0022] ァリールとは 1 ~ 2個の置換基を有しても良いフエ二ル基を意味し、 ί列えば、 フヱニル、 ト リ ル、 キシリ ル、 ク メニル、 ο-, m-, p-クロ 口 フ ェニル等が例示される。 C 3〜 C 7アルキレンとは具体的にはブ Πビレ ン、 ブチレン、 ペンチレ ン、 へキ シ レ ン、 ヘプチレン等が例示でき る。
    [0023] 以下に本発明化合物の代表例を列挙するが、 本発明はこれらに限定さ れるものではない。
    [0024] (1) 7 -ク ロ ロ ー 2 -(P-ジェチルァ ミ ノ フエニル〉 - 2 H-ベンゾ ト リ ア ゾ リ ル- 5—ァ ミ ン、
    [0025] (2) 7 -ク ロ 口 - 2 -(p-メチルァ ミ ノ フエ二ル）— 2 H-ベンゾト リ アゾリ ル - 5一ァ ミ ン、
    [0026] (3) 7 -ク ロ 口 - 2 -〈ρ -ァ二 リ ノ フエニル）ー 2 Η-ベンゾ ト リ アゾリルー 5 -ァ ミ ン、
    [0027] (4) 7 -ク ロ 口 - 2 -(Ρ-モリレホ リ ノ フエニル） - 2 Η-ベンゾ ト リ アゾリル- 5 -ァ ミ ン、
    [0028] (5) 6 -ァ ミ ノ - 2 -(Ρ-ジェチルァ ミ ノ フ エ ニル） - 2 Η-ベンゾ ト リ ァ ゾ一ル - 4 -カルボン酸 ' ェチルエステル。
    [0029] (6) 2—(Ρ-シク ロへキシルァ ミ ノ フエニル） - 2 Η-ベンゾト リァゾリル- 5 -ァ ミ ン、
    [0030] (7) 7 -シァ ノ - 2 -(ρ-ビベリ ジノ フエニル）一 2 Η-ベンゾ ト リ ァゾリ ル- 5 -ァ ミ ン、
    [0031] (8) 7 -ブロモ - 2 -(Ρ-シク ロ プロ ビルァ ミ ノ フエ二ル）— 2 Η-ベンゾ ト リァゾリ ル- 5 -ァ ミ ン、
    [0032] (9) 7 -ク ロ 口 - 2 -(Ρ-ビベラ ジノ フエニル）一 2 Η—ベンゾ ト リ アゾリル- 5 -ァ ミ ン、 および
    [0033] αθ) 6 -ァ ミ ノ - 2 -(Ρ-ジイ ソベンチルァ ミ ノ フエニル〉 - 2 Η-ベンゾ ト リ アゾール - 4 -カルボン酸 ' メチルエステル。
    [0034] これら本癸明化合物を用いて、 （1)薬物と蛋白の結合力、 および (2)血中 蛋白量を容易にかつ正確に測定できる。 以下に例を示して、 測定: &法を 簡単に説明する。
    [0035] (1)薬物と蛋白の結合力の測定
    [0036] (塩基性薬物と 0£ A Gの結合力）
    [0037] a A Gと先に示した本発明化合物を含む溶液、 ならびに a i -A G , 化合物および薬物を含む溶液の 2種類を調製して、 表 2に示した励起 · 螢光波長における螢光強度を測定する。 別途作成した検量線よりそれぞ れの溶液中における化合物の a Gに対する結合率を測定し、 薬物共 存下および非共存下での結合率の違いから薬物の a i -A Gに対する結合 定数を算出する。
    [0038] (2)血中蛋白量の測定
    [0039] ( アルブ ミ ンの定量）
    [0040] アルブミンを含む試料溶液に化合物を含む試料溶液を加え、 表 2に示 した励起 · 螢光波長における螢光強度を測定する。 アルブミン標準溶液 にて作成した検量線より試料中のアルブミン濃度を求める。
    [0041] ( ！ - A Gの定量：）
    [0042] a t - A Gを含む試料溶液にスルホサリチル酸を加えて共存する他の蛋 白を除去する。 次いで化合物を含む試料溶液を加えて、 表 2に示した励 起 · 螢光波長における螢光強度を測定する。 0 -A G標準溶液にて作成 した検量線より、 試料中の o^- A G濃度を求める。
    [0043] 以下に実施例を示し、 本発明を更に詳しく説明するが、 これらは本発 明を何等限定するものではない。
    [0044] 実施例
    [0045] 以下に示す実施例 1〜 5で本発明化合物 1〜 5を製造した。 物理恒数 を表 1に示す。 実施例 1
    [0046] 7 -ク 口 a - 2 -(p-ジェチルァ ミ ノ フエ二ル）— 2 H-ベンゾ ト リ ァゾ リ ル -5 -ァ ミ ン（ 1〉の製造
    [0047] N , N -ジェチル- P-フ ヱニ レ ン ジァミ ン 2塩酸塩（ 1 0 mniol：)を 1 0 %塩酸 5 0 mlに溶かして、 氷冷下、 攪拌しながら 1 0 %亜硝酸ナ トリゥ ム水溶液（ 7ml)を加えた。 1 5分後、 1 0 %スルファ ミ ン酸アンモニ ゥ ム水溶液（ 1 5 ml)を加え、 さ らに 1 5分間攪拌した。 酢酸ナ トリゥ ムにて反応液の液性を約 pH 5 と した後、 5-クロ口- m-フヱニレンジァ ミ ン （ 1 Oramol)を力 Πえ、 2時間攪拌した。
    [0048] 反応液を 1N-水酸化ナ トリゥム水溶液にて約 pH 9 と した後、 酢酸ェチ ルにて抽出した。 酢酸ェチル層を減圧下で濃縮した後、 残渣をビリ ジン C 4 0 ml) に溶かした。 この溶液にアンモニア性硫酸銅溶液（硫酸銅 · 5水和物 1 0 gを 1 4%アンモニア水 6 Omlに溶かしたもの）を加え、 4時間還流した。 次に、 反応液を冷却後、 酢酸ェチルにて抽出した。 酢 酸ェチ 層を無水硫酸ナ トリゥムにて乾燥させた後、 減圧下で濃縮し、 残渣を酢酸ェチル （ 5 ml ) に溶かした後、 シリ 力ゲルクロマ 卜グラ フ ィ ー （酢酸ェチル） にて精製し、 化合物 1を得た。
    [0049] 実施例 2
    [0050] 7 -ク ロ ロ - 2 -(p-メチルァ ミ ノ フエ二リレ） - 2 H-ベンゾ ト リ アゾリル- 5 -ァ ミ ン（ 2〉の製造
    [0051] Ν, Ν -ジェチル -P-フ エ二 レ ン ジァ ミ ン 2塩酸塩を Ν -メ チル - ρ- フ エ二レ ン ジアミン 2塩酸塩に代える以外は実施例 1 と同様の操作を行 ない、 化合物 2を得た。
    [0052] 実施例 3
    [0053] 7 -ク π π - 2— Ρ-ァ二 _リ ノ フ エニル）ー 2 Η-ベンゾトリァゾリルー 5 - ァ ミ ン（ 3 )の製造
    [0054] N, N-ジェチル -P -フ エ二 レ ンジァミ ン 2塩酸塩を N-フェニル フ 二レ ンジァミン 2塩酸塩に代える以外は実施例 1 と同様の操作を行 ない、 化合物 3を得た。
    [0055] 実施例 4
    [0056] 7 ク ロ 口 2—(P -モリレホリ ノ フエニル〉 - 2 H-ベンゾ 卜 リアゾリル- 5 -ァ ミ ン（ 4 )の製造
    [0057] N , N-ジェチル フ工ニレンジァ ミ ン 2塩酸塩を p -モルホリ ノァニ リ ンに代える以外は実施例 1 と同様の操作を行ない、 化合物 4を得た。 実施例 5
    [0058] 6—ア ミ ノー 2 -(p—ジェチルァ ミ ノ フエニル〉 -2 H-ベンゾトリァゾー ル -4-カルボン酸 ェチルエステル（ 5 )の製造
    [0059] 5 -ク ロ 口 -m-フェニ レンジア ミ ンを 3， 5 -ジァ ミ ノ安息香酸ェチル エステル 2塩酸塩に代える以外は実施例 1 と同様の操作を行ない、 化合 物 5を得た。
    [0060] 以下の実施例 6〜 1 0で本発明測定用試薬の調製例を示す。
    [0061] 実施例 6 ( 1 X 1 0 _5M水溶液）
    [0062] 化合物 1 を 3 1. 6mg軒量し、 0. 1 N塩酸 1 0mlに溶解した後、 水を 加えて全量を 1 0 とする。 この溶液を 5 mlずつ褐色バイアル瓶に分注 ♦ 密栓して測定用試薬を得る。
    [0063] 実施例 7 1 X 1 0—5Mメタノール溶液）
    [0064] 化合物 2を 2 7. 4mg秤量し、 メタノールに溶解して全量を 1 0 £ と する。 この溶液を 5 mlずつ褐色バイアル瓶に分注 ·密栓して測定用試薬 を得る。
    [0065] 実施例 & ( 1 X 1 0 -5Mエタノール溶液） 化合物 3を 3 3. 6 mgとエタノールを用いた以外は実施例 7と同様に して測定用試薬を得る。
    [0066] 実施例 9 ( 1 X 1 0 _4Μ水溶液）
    [0067] 化合物 4を 3 3. Orag用いた以外は実施例 6と同様にして測定用試薬 を得る。
    [0068] 実施例 1 0 ( 1 X 1 (T4Mメタノール溶液）
    [0069] 化合物 5を 3 5. 3 mg用いた以外は実施例 7と同様にして測定用試薬 を得る。
    [0070] 表 1
    [0071] 表 2
    [0072] 実施例 1 1
    [0073] クロルブロマジンの結合定数の測定
    [0074] (実験 1 )
    [0075] A Gの濃度 1 X 1 0 -4M、 pH 7 · 4の 0. 1 Mリン酸緩衝液溶液 2mlを石英製栓付螢光セルにとり、 これに化合物 1の 5 X 1 0 水溶 液 (：ィヒ合物 1約 3 mgを 1 N塩酸 1 mlに溶かした後、 水にて 200倍希釈 したもの）をマイクロシリンジにて 2 ずつ添加し、 十分に混ぜた後、 5 08 nmの螢光強度〔励起波長 418 nm)を測定した。 この場合、 ィ匕合 物 1はすべて Ct AGと結合し、 濃度と螢光強度の閬係は図面に示す直 線 1の様になった。
    [0076] (：実験 2 )
    [0077] の濃度 3 X 1 (TeM、 pH7.4の 0.1 Mリン隨衝液溶液 2 mlにっき、 実験 1と同様の操作を行なった。 この場合、 化合物 1と α广 A Gの結合は平衡状態にあり、 濃度と螢光強度の関係は図面に示す 曲線 2の様になった。
    [0078] (実験 3 )
    [0079] ク πルブロマジン 1 X 10_61^を含む(¾1- &の濃度3 X 1 (TeM、 pH 7.4の 0. 1 Mリン酸緩衝液溶液 2 mlにっき、 実験 1と同様の操作を 行なった。 この場合、 化合物 1 と a i-A Gの結合はクロルブロマジンに よ り阻害され、 濃度と螢光強度の閧係は図面に示す曲線 3の様になつ た。
    [0080] C計算 法）
    [0081] 化合物 1の 0£ i-A Gに対する結合率（ X )は下式（1)により求めた。
    [0082] Fp - Fo ,
    [0083] X = (1)
    [0084] Fb 一 Fo こ こで.、 Fbは実験 1 によ り得た化合物 1のある濃度における螢光強 度であり、 Fpは実験 2によ り得た化合物 1の同濃度における螢光強度 であり、 Foはブランク値である。
    [0085] 化合物 1の各濃度における結合率から得た値を Scatchard の式（2)に 従ってブ π ッ トすることにより、 化合物 1の (X i-A Gに対する結合パラ メータを得た。 r /Df = n Ka - r Ka (2)
    [0086] こ こで、 rは a t-A G 1モル当りの化合物 1の結合量、 nは結合サイ ト数、 Kaは化合物 1の結合定数、 Dfは遊離型の化合物 1の濃度であ る。 ィヒ合物 1の a !-A Gに対する結合パラ メータは、 Ka= 1.4 6 X 1 0 -6M n=0.40 だった。
    [0087] ク πルブロマジンの結合定数は以下の Klotzらの式により求めた。
    [0088] ， nPtKaDf― KaDfDb - Db KaDf
    [0089] Kb =
    [0090] BtKaDf - nPtKaDf + KaDfDb + Db Db ここで、 K aおよび Kbは、 それぞれ、 化合物 1およびクロルプロマジ ンの結合定数であり、 P tおよび B tは およぴクロルブロマジン の総濃度であり、 nは結合サイ ト数である。 D fおよび D bは、 それぞ れ、 実験 3により求めたク πルブロマジン添加時の化合物 1の遊離型お よび結合型の濃度である。
    [0091] ク πルブロマジンの結合定数を表 3 に示す。
    [0092] 実施例 1 2
    [0093] 表 3 に示すその他の塩基性薬物について、 実施例 1 1 と同様の: &法で 結合定数を求めた。 結果を表 3に.合わせて示す。
    [0094] 表 3 薬物 log Kb 薬物 log Kb ク 口 Jレブロマジン 6 . 4 6 キニジン 6 . 1 8 ア ミ ト リ プチリ ン 5 . 5 8 ジルチアゼム 5 . 4 0 ト リ ミ ブラ ミ ン 5 . 6 1 ビン ドロール 5 . 3 3 ィ ミ ブラ ミ ン 5 . 5 4 二カルジピン 6 . 7 8 デシブラ ミ ン 4 . 8 6 リ Fカイン 5 . 1 2 ブロ ク πペラジン- 6 . 2 4 ブロブラノ π— Λ· 5 . 8 5 レボ メ ブ ϋマジン 6 . 0 1 ジ'レノ 口一 Jレ 4 . 6 9 ブロ メ タ ジン 4 . 9 4
    权利要求:
    Claims
    (1) 次式 ：
    請
    (式中、 R1は水素、 低級アルキル、 ハロゲン、 シァノまたは低級アル キルォキシカルボニルを表わし、 R 2および R 3は各々、 水素、 低級アル キル、 C 3〜 C7シク ロアルキルもし くはァリールを意味するか、 または 囲
    —緒になって C3〜 C7アルキレンを表わすか、 あるいは隣接窒素原子と 一緒になって ビペラジノもし くはモルホリノを形成する。 ：）で表わされ る化合物またはその塩。
    (2) 次式 ：
    (式中、 R 1は水素、 低級アルキル、 ハロゲン、 シァノまたは低級アル キルォキシカルボニルを意味し、 R2および R3は各々、 水素、 低級アル キル、 C 3〜 C7シクロアルキルも し くはァリールを意味するか、 または 一緒になつて C3〜 C7アルキレンを表わすか、 あるいは隣接窒素原子と 一緒になつてビペラジノも し くはモルホリノを形成する。 ）で表わされ る化合物またはその塩を含有する事を特徴とする蛋白結合測定用または 蛋白定量用試薬。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    US5132429A|1992-07-21|
    DE68921338T2|1995-06-29|
    JPH01305069A|1989-12-08|
    EP0418386A4|1991-11-21|
    AT118769T|1995-03-15|
    DE68921338D1|1995-03-30|
    EP0418386A1|1991-03-27|
    EP0418386B1|1995-02-22|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-12-14| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1989-12-14| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1990-11-30| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1989906434 Country of ref document: EP |
    1991-03-27| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1989906434 Country of ref document: EP |
    1995-02-22| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1989906434 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP13483588A|JPH01305069A|1988-05-31|1988-05-31|Benzotriazole derivative and fluorescent light emitting reagent containing the same derivative|
    JP63/134835||1988-05-31||DE1989621338| DE68921338T2|1988-05-31|1989-05-25|Benzotriazol-derivate und diese enthaltende fluoreszierende reagenzien.|
    EP19890906434| EP0418386B1|1988-05-31|1989-05-25|Benzotriazole derivatives and fluorescence-emitting reagents containing them|
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